周囲振動の偏りを軽減した光コヒーレンスエラストグラフィーによる細胞、オルガノイド、組織の機械的特性のプロファイリング

Jul 16, 2023

Communications Biology volume 6、記事番号: 543 (2023) この記事を引用

396 アクセス

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

組織の機能、発達、成長を定義する際の機械的環境の役割は、基本的なものであることが示されています。 複数のスケールでの組織マトリックスの剛性の変化の評価は、細胞培養のワークフローにはあまり適さない AFM や機械的検査装置などの侵襲的で多くの場合専門的な装置にほとんど依存していました。この論文では、バイアスのないパッシブ光コヒーレンス エラストグラフィー法を開発しました。 、サンプル内の周囲振動を利用して、細胞および組織のリアルタイムの非侵襲的定量的プロファイリングを可能にします。 散乱に関連するノイズバイアスを積極的に補償し、分散を低減することにより、光学散乱と機械的特性を分離する堅牢な方法を実証します。 グラウンド トゥルースを取得する方法の効率は、コンピュータおよびインビトロで検証されており、骨および軟骨スフェロイドの経時的機械プロファイリング、組織工学癌モデル、組織修復モデル、単一細胞などの主要なアプリケーションで実証されています。 私たちの方法は、ハードウェアを変更することなく、市販の光干渉断層撮影システムで容易に実装できるため、オルガノイド、軟組織、および組織工学の空間機械的特性のオンライン組織機械的評価に画期的な進歩をもたらします。

組織の恒常性における機械的環境は、複数の臓器の機能、発達、および病理の基本であることが示されています1、2、3。 マトリックスの剛性は、多くの生物学的および医学的用途において有益な指標となりえます。 組織工学では、移植後の臨床的成功には、人工移植片のバルクおよび空間的機械的特性が極めて重要です4、5、6、7。 たとえば、栄養素を制限すると、人工軟骨の中央領域がより柔らかくなる可能性があります8,9。 がん研究では、硬さが悪性組織と健康な組織を区別しており 10、抗がん剤治療に応じた 3D がん細胞モデルの硬さの変化をモニタリングすることで、薬剤の有効性が示される可能性があります 11。 目の場合、角膜の硬さは眼圧下での光学性能を示します12。 人工組織の機械的特性を試験するための従来のアプローチは、通常、組織との直接接触を必要とし、細胞培養の停止を伴う非無菌である 13,14。 さらに、操作された組織の空間的機械的不均一性についての局所的な洞察ではなく、バルク値のみが提供されます。 製造または長期培養には、3D 培養に損傷を与えることなく簡単に継続的にモニタリングできる必要があり、光学システムが潜在的なソリューションを提供します。 したがって、細胞播種マトリックス、オルガノイド、または体外外植片などのインビトロ 3D 組織のバルクおよび空間機械的特性を無菌オンラインでモニタリングするシステムが必要です。

エラストグラフィーとして知られるプロセスである剛性の定量化と空間マッピングは、一般に、試験片を刺激し、その変形を測定し、パラメーター化されたモデルにフィッティングすることで機械的特性を推測することによって実行できます。 エラストグラフィーは、最初は超音波画像法で実装され 15、次に MRI 16、そして最近では最近見直された光学的手法で実装されました 17。 光コヒーレンストモグラフィー (OCT)18 は、高解像度の非侵襲的 3D イメージング能力 19 と、位相を通じて変位を正確にエンコードできる能力 20 により、小さなサンプルのエラストグラフィー変形追跡に特に適しています。

初期の光コヒーレンスエラストグラフィー（OCE）法では、スペックル追跡による表面圧縮 21,22 とその後の位相遅れ測定 23 が使用されていましたが、この概念は他の多くの接触および非接触形式の刺激で実現されています 24。 成功したアプローチの 1 つは、エアパフを介して点動的荷重から材料内に制御されたせん断波を発射し 25、OCT を使用して空間分解された波の速度を測定することです。これは材料の剛性と密接に関係しており 26、生体内で実証されています 27。 自然に発生する広帯域拡散せん断波は、せん断波長 28,29 の測定にも利用できます。この概念は、Nguyen ら 30 によって OCT で使用されており、「パッシブ エラストグラフィー」と呼ばれています。 Zvietcovich et al.31 による密接に関連したアプローチは、単一周波数で振動する接触点源の配列からの残響波からせん断波長を測定し、体外で角膜の硬さを定量化するために適用することに成功しました。

パッシブ エラストグラフィーは、ハードウェアを追加変更することなく OCT システムで実行できるため、機械的コントラストを実現するための魅力的な技術です。 材料に接触する必要がなく、組織工学用途の分析を無菌的に行うことができます。 取得は非同期であり、振動源に対して遅いため、ローフレームセンサーの使用が可能ですが、参考文献の相互相関ベッセルフィットアルゴリズムを使用して一連の変位場からせん断波長を推定することができます。 31 または参照の変位対ひずみエネルギー比。 しかしながら、前者はフィッティング平面全体にわたって空間分解能が制限されているが、後者は本質的に、さまざまなレベルのノイズによってバイアスがかかっている。 したがって、局所波長の空間的に変化する偏りのない推定を形成するための偏りのない周囲振動 OCE と呼ばれる解析を提案します。これは、異なるサイズと光学散乱特性の材料に適しています。

まず、式 1 に従って、二相材料内を伝わるせん断波をシミュレートしました。 (4) (図 1a) は、青色の領域では λ1 = 2 mm、黄色の領域では λ2 = 4 mm の波長を持ち、比較した場合に低速で非同期の取得でグランド トゥルースを取得するアルゴリズムのパフォーマンスをテストしました。振動源に。 材料（x-y平面）内を伝わるせん断波によって誘発される変位場に対応する微速度位相測定（N = 195）は、加法性白色ガウスノイズ（分散σ = 0.05）を使用して図1bでシミュレートされています。 x 軸に沿った波長を推定する OCE アルゴリズムへの入力として使用されます (図 1c)。 参考文献に示されているパッシブ OCE アルゴリズム。 30 は測定時のノイズによってバイアスされており、これは理論的に示されています。 この効果は図 1c に示されており、図 1d ではさまざまなノイズ レベル分散を使用してさらに調査されています。 OCT からの変位推定値のノイズは信号対ノイズ比に関連しているため 32,33、このパッシブ エラストグラフィーのコントラストは材料の散乱特性に直接関係しています。 したがって、剛性は同じだが光学散乱が異なる材料は、このアルゴリズムでは誤って区別されます。 この問題を軽減するために、このノイズ バイアスを積極的に補償し、空間フィルタリングを通じて分散を低減するアプローチを提案します。 この効果は、図 1a の波長マップと図 1c のライン プロファイルで実証されています。 バイアスを軽減した推定値は平均誤差を補正しますが、バイアスと分散のトレードオフに起因して、大量の分散が生じます。 最後に、私たちが提案するバイアスを除去した周囲振動 OCE アルゴリズムは、グランド トゥルースに非常に近い、バイアスを除去した分散の低い推定値を生成します。 最も重要なことは、図 1d のさまざまなノイズ レベルに対して傾向が一貫していることです。これにより、散乱強度と機械的コントラストを切り離すことができます。

a は、波長 λ1 = 2 mm および λ2 = 4 mm で二相材料内を横方向に伝わる波のグランド トゥルースを示します。これは、式 1 によるパッシブ エラストグラフィーからの偏った推定です。 (6)29、式 (6) からの高分散偏りのない推定値。 (8) と、式 (8) から提案される偏りのないフィルタリングされた推定値。 (9)、機械的なコントラストを形成します。 図では波長がカラーバーに従って色分けされています。 b は、ノイズの多い背景を加えたグラウンド トゥルースから計算された変位場によって引き起こされる、シミュレートされたタイムラプス位相測定を示しています。 c a の色付き領域を通るライン プロファイルを表示します。 パネル d は、増加するノイズ レベルでのパッシブ エラストグラフィー (すべて赤い線) とバイアスを軽減した周囲振動 OCE (青い線) について推定された波長バイアスです。

弾性波長を確実に測定することで、剛性を推定することができます。 たとえば、線形弾性等方性材料の場合、E ∝ λ2、ここで E はヤング率、λ はアルゴリズムによって推定された波長です。 校正と同じ条件下での測定を通じて、比例定数を見つけることができます。 波長と弾性率の関係の詳細を以下にまとめます。

次に、さまざまな剛性の無細胞アガロースゲルを使用してアプローチを検証しました。これは図2にまとめられており、実装と処理の詳細と実験プロトコルは「方法」で完全に説明されています。 OCT イメージング後、標準的な圧縮試験を使用してこれらのゲルのヤング率を測定しました。 これらのヒドロゲルのOCT強度画像と計算された機械的コントラストマップを図2aに示します。 すべてのゲルには同じ量の光学造影剤が含まれていますが、光学散乱と機械的特性を分離するために、その剛性と相関することが示されている異なる濃度のアガロースが含まれていました 34。 λ マップからの濃度が増加すると、剛性推定値が目に見えて増加します。 図 2c に示すように、各ゲル濃度のグループのヤング率 (n = 3) と比較すると、この材料のモデル E ∝ λ2 を裏付ける強い線形相関 (r = 0.994) が存在します。 今後、平均波長の二乗 λ2 を「相対剛性」と呼びます。

a 強度と機械的コントラストの例を示します。 すべての写真のサイズは 3×3 mm です。 パネル b は、式 1 にあるようにフィッティングされたシグモイド導関数の FWHM として計算されたエッジ ライン プロファイルと空間解像度です。 (13); 対応する軸方向エッジの空間解像度は 38.1 μm であることがわかりました。 c 機械的キャリブレーションは、式 1 の弾性モデルを仮定して、Bose ElectroForce (n = 3) の波長の 2 乗とヤング率の間の線形フィットとして実行されます。 (3); エラーバーは標準偏差を示します。 OCT 強度画像は平均強度の対数として表示されます。

図2aに示すハイブリッドアガロースは、参考文献のものと同様に、不均一な剛性と局所的な変動を測定する能力を示しています。 30. この場合、私たちのアルゴリズムは、ゲルの 2 つの半分の間に、深さと一致する鋭いコントラストを生成します。 最後に、図2bの対応するプロファイルを使用して、エッジ遷移からの方法とシステムの空間解像度を横方向に47.4μm、軸方向に38.1μmと推定しました。これは、参考文献によって報告されたものと同等です。 31; 空間解像度を計算する方法については、「方法」セクションで詳しく説明します。 バイアスを除去しなくても、パッシブエラストグラフィーでも、参考文献に示されているように同様の機械的コントラストを提供できます。 しかし、せん断波長の定量的測定は、特にノイズが存在する場合（図 1d）では大幅に過小評価されます（図 1c および S2d を参照）。 対照的に、バイアスを除去した周囲振動 OCE は、ノイズが存在する場合でも (図 1d)、シミュレーションでの波長の正確な値 (図 1c)、および機械的測定とよく相関する実際のサンプルの波長の現実的な値を提供します。 (図2cを参照)。

整形外科組織工学におけるマトリックス剛性分析は、医療用インプラントの製造の評価および潜在的な結果の測定にとって重要です。 骨組織工学における偏りのない周囲振動 OCE 解析の応用として、骨形成分化において間葉系幹細胞 (MSC) ペレットを 21 日間培養し、同時に無菌オンライン方式で偏りのない周囲振動 OCE を使用してそれらの剛性を継続的に測定しました。 検証は、エンドポイントの機械的テストを使用してサンプルのサブセットに対して実施されました。 図 3b に示す機械的試験から、培養全体を通じて人工骨組織のヤング率が顕著に増加しています。 この機械的コントラストの増加は、時間の経過に伴う各ペレットの図 3a の λ マップでも明らかです。 次に、偏りのない周囲振動OCEによる相対剛性を各ペレットにわたって定量化し、図3cに示します。これは、機械的試験データと一致して、各サンプルの培養期間にわたる単調増加を示しています。 骨形成ペレット中のコラーゲンの染色の増加が培養時間とともに観察され、これは培養によるマトリックス含有量の増加を示し、機械的試験データおよびOCT分析をさらに裏付けるものである。 空間的不均一性は、機械的コントラスト マップと組織学の両方で観察されました。

パネル a は、3 日目、10 日目、および 21 日目の人工骨組織 (三重) の強度と機械的コントラストの例です。提示されたすべての写真は 1 × 1 mm です。 b カスタマイズされた圧縮リグによってテストされた組織のヤング率を示します (n = 4)40。 パネル c は、培養全体にわたる各サンプルの相対的な剛性です (n = 3)。 d 3、10、および21日目の骨形成ペレットのコラーゲン含有量についてのピクロシリウスレッド染色による組織学。オレンジ色の染色は細胞質を示し、赤色の染色は新しく合成されたコラーゲン原線維を示します。 スケールバー：100μm。 e 21 日間静水圧によって刺激された人工軟骨組織の強度と機械的コントラストを示します。 パネル f はサンプルのグリコサミノグリカン (GAG) 含有量 (n = 4)、g はバイアスを除去した周囲振動 OCE 分析からの相対剛性を示します (n = 3)。 * は p < 0.05 の有意差を示し、** は p < 0.01 の有意差を示します。これは、一元配置分散分析とそれに続く平均値の Tukey-Kramer 比較で計算されます。 エラーバーは標準偏差を表します。

次に、軟骨形成培地で 21 日間培養した MSC 細胞ペレットに偏りのない周囲振動 OCE 解析を適用しました。 N=3 サンプルには静水圧をかけて区別をさらに強化し、残り (N=3) は対照として保持しました。 予想どおり、生化学分析では、図3fに示すように、刺激されたグループのグリコサミノグリカン（GAG）含有量の増加が示され、剛性の増加を示唆しています。これは、図3eのλマップと要約された定量分析の両方によく反映されています。図3gの。

私たちは、組織工学的に作製された癌モデルの空間機械的特性をモニタリングするための、癌研究における偏りのない周囲振動 OCE の可能性を調査しました。 まず、線維芽細胞を播種したコラーゲンゲルを 11 日間培養しました。 予想通り、我々の分析では、培養時間に応じて線維芽細胞を播種したコラーゲンゲルの相対的な剛性が着実に増加していることが示されました（図4a、b）。 次に、卵巣がん細胞をコラーゲンゲルの上に7日間播種し、2つの間の機械的コントラストを分析することでコラーゲンゲル層と容易に区別できました（図4c、d）。 これは組織学によって裏付けられました（図4e、f）。

a 11 日間培養した線維芽細胞を播種したコラーゲンゲルの強度と機械的コントラストを示します。 掲載されている写真はすべて6×3mmです。 b 時間の経過に伴う対応する剛性を示します。 c 上で 7 日間培養した癌細胞の有無によるコラーゲンゲルの強度と機械的コントラストを示します。 d c に表示されている赤い線に沿って測定された機械的特性。 e、f ヘマトキシリンおよびエオシンで染色したcの組織像。 スケールバー: 1 mm。

OCT は眼科用の日常的なツールであり、私たちの方法はこれらの機能を表面再構成の日常的なモニタリングに拡張することができます。 したがって、小さな角膜病変を修復するためのゲルシステムの品質と効率を評価するために、偏りのない周囲振動OCEの可能性を調査しました。 ブタ角膜 (N = 3) に生検パンチを施し、局所的な傷を形成しました。 次に、15％または20％のメタクリル化シルクフィブロイン溶液を損傷部位に注射し、UV架橋し、OCTで画像化しました（図5a）。 偏りのない周囲振動 OCE 分析では、20% ゲル グループの相対剛性が著しく高いことが示されました。これは、レオロジー テストで得られた機械的データと一致しています (図 5b、c)。 OCT 強度画像では、どちらのグループでもゲルと角膜の間の界面に明らかな空隙は見られませんでしたが、機械的コントラスト (λ) マップ (白い矢印を参照) では両方のグループで明確な空隙が確認され、未硬化のゲル溶液の存在が示されました。 。 これは、偏りのない周囲振動 OCE が組織修復の品質と効率を評価するための強力なツールとなり得ることを示唆しています。

a 無傷のブタ角膜と 2 つの異なる濃度のヒドロゲルを移植した後のブタ角膜の強度と機械的コントラストを示します。 白い矢印は未硬化ゲルの領域を示し、高い機械的コントラストを示しますが、強度は示しません。 b ヒドロゲルのサンプルからのレオロジーからの貯蔵弾性率を示します (n = 3)。 c OCT スキャンからの相対的な剛性を示します (n = 3)。 d マウス卵母細胞の機械的特性に関する研究を示します。無傷の透明帯および透明帯を含まない野生型卵母細胞と、無傷のヒストン H3.3 ノックアウト卵母細胞の比較。 透明帯が無傷の野生型卵母細胞は、透明帯のない、発育能力の低い透明帯無傷の H3.3 ノックアウトとは著しく異なる、より大きな剛性の不均一性を示します。卵母細胞の写真は 100 × 300 マイクロメートル (x – z) にトリミングされています。 * は p < 0.05 の有意差を示し、** は p < 0.01 の有意差を示します。これは、一元配置分散分析とそれに続く平均値の Tukey-Kramer 比較で計算されます。 エラーバーは標準偏差を表します。

定期的な妊孕性研究には、受精前の卵母細胞の生存能力と発育能力の評価が含まれる場合があります。 最近の研究では、卵母細胞の硬さがその生存率と胚発生の可能性に関連していることが示唆されています 35。 マウス卵母細胞への偏りのない周囲振動 OCE 解析の適用を図 5d にまとめます。 私たちは、野生型マウスからの無傷卵母細胞と透明帯を除去した卵母細胞、および胚の発育停止を引き起こすことが示されている Cabin1 ノックアウト卵母細胞を比較しました。 まず、平均波長の有意な差が対照群に対して観察されました。これは、参考文献にあるように生存率を評価する手段となる可能性があります。 35、37。 機械的コントラストマップは、帯なしおよび帯が無傷のcabin1ノックアウトマウスと比較して、帯が無傷の野生型の外側リングを示しました（図5d）。 これは、マイクロピペットによる吸引とは対照的に、偏りのない周囲振動 OCE が、非侵襲的な方法で発育能力のある卵母細胞を非接触でスクリーニングするための効果的なツールとなり得ることを示唆しています。

偏りのない周囲振動解析は、OCT スキャンから定量的な機械的コントラスト マップを導出する後処理アルゴリズムであり、散乱と機械的特性を分離します。 このアプローチは、実験室条件で複数の発生源によって生成される周囲の弾性波の波長推定に基づいています。 光学研究室では、通常、振動のない環境で実験を行うことが求められます。 しかし、暖房、換気、空調、保育器、ポンプ、コンピューター、科学機器、道路や鉄道輸送システムなど、近くおよび遠くにある多数の振動源が積み重なると、周囲の環境と結びついて避けられない振動性の暗騒音が発生します。 この目的を達成するために、光学システムは専門のパッシブまたはアクティブ振動テーブル上に構築されます。 しかし、私たちの研究では、周囲の振動から最大限の恩恵を受けるために、OCT システムを意図的にベンチ上で動作させています。

さらに、FEM 解析を実施して、ウェルプレートに加えられた外部振動がサンプル内に十分な波を生成することを示しました。 また、私たちの実験設定では、大きな変位によって引き起こされる位相のラッピングやアーティファクトを避けるために、ゴム製のベースを備えたチャンバー内にプレートを配置することで、環境振動の規模を低減する措置を講じる必要があることにも注目してください。

人体の活動から自然に発生するせん断波が組織の弾性特性を定性的に評価するために使用されているため、周囲の振動も in vivo 研究に関連しています 28,38。

さらに、in vivo パッシブ光コヒーレンス エラストグラフィーの可能性は、麻酔をかけた目のラットの角膜に対しても実証されています 30。

空間分解能はあらゆるイメージング手法にとって重要な考慮事項であり、さまざまな材料の剛性を解決できることが OCE の主な利点です。 理論的には、私たちの方法はひずみパワーが計算されるピクセル数またはフィルター カーネルによってのみ制限されます。 図 2 のアガロースの研究では、7 ピクセルのスライディング ウィンドウで横方向のひずみを計算し、空間標準偏差 5 ピクセルのガウス フィルターを使用します。これにより、FWHM は 11.8 ピクセルとなり、予想される空間解像度は横方向で 41.3 μm、20.9 μm になります。軸方向のμmは、エッジ遷移から経験的に測定した47.4μmおよび38.1μmに匹敵します。 ノイズが存在する場合、バイアス、空間解像度、分散の間にはトレードオフがあり、パラメータ Ng と Nh によって制御できます。 ノイズが高くなると、一定の精度で達成可能な空間分解能が低くなります。そのため、信号を減衰させずに透過を低減しながら、高い SNR を実現するには光散乱のレベルが重要です。 最後に、粘弾性を無視して、平均波長を相対剛性と呼びます。 これは、軟らかい非圧縮性組織では、パッシブエラストグラフィーで一般的に使用されるように、弾性挙動がせん断弾性率によって支配され、せん断弾性率はせん断波の波長の二乗に比例して変化するという事実によって動機付けられました 30。 測定されたヤング率とせん断波の波長の二乗の間に強い線形依存性（r = 0.994）を示す実験データ（図2c）は、粘弾性挙動がこの近似では無視できることを検証しました。 私たちの研究では、文化または結果の評価において剛性が中心的な評価である一般的な例を使用してアプローチを検証しました。 私たちの結果は、無傷組織の分化中に軟骨や骨などの整形外科組織を評価する方法、組織工学による癌モデル、体外での卵母細胞の生殖能力評価、および移植後の経時的な生体材料の剛性を評価できる眼科応用をどのように行うことができるかを示しています。

偏りのない周囲振動 OCE は、OCT からの標準散乱強度画像から分離された定量的機械コント​​ラスト画像 (λ マップ) とこの追加情報を生成するため、3D 培養において生体材料および生体マトリックスを in vitro で空間的に評価するための強力なツールです。標本の重要な変化を示すために使用できます。 さらに、領域の「相対剛性」を平均二乗波長として抽出できます。これは、アガロースサンプルで検証されているように、等方性線形弾性材料のヤング率に直接比例します。 我々は、さまざまなマトリックス特性を持つ生物学的システムを使用して、この効果的で「使いやすい」アプローチが、オルガノイド、軟組織、および組織工学の空間機械的特性のオンライン組織機械的評価に画期的な進歩をもたらすことを示します。

アガロースおよびhMSCペレットの研究に使用したシステムは、スキャンレンズ(LSM03 Thorlabs)を備えた中心光源波長1310nmのThorlabs Telesto-IIスペクトルドメインOCTシステムで、組織内での軸方向分解能4.1μm、横方向分解能2.5μmを実現しました。 15マイクロメートル。 取得は 192 フレームで構成され、各フレームには 48 kHz のレートで 1000 の A スキャンが含まれます。 卵母細胞および癌播種コラーゲンゲルの場合、システムはスペクトル帯域幅 92 nm の Wasatch Photonics 800 nm システムで、測定は 30 kHz のレートで 512 A スキャンの 100 フレームで構成されました。 すべての場合において、サンプルは、振動の伝達を可能にするために、OCT プローブと同じベンチ上の標準的な組織培養ウェル プレートに配置されました。

前処理は、分光計を k 空間にリサンプリングし、バックグラウンド信号を除去し、高速フーリエ変換を行って複素数値の遅延空間にマッピングするために特注のソフトウェアで実行されました。 後続のフレーム間の変位フィールドは次のように推定されました。

ここで、λ0 は光源の中心波長、neff はサンプルの実効屈折率、ℜ と ℑ は実数部と虚数部を表し、pt+1 は pt からのその後の複素測定値です。 これらの変位場から、() によって弾性波長が推定されます。

次のように与えられる波の速度を通じて、空間的に分解された材料の剛性を推定したいと考えています。

ここで、ρ は質量密度、M は弾性率係数です。 この一般的な形式は以下に適用されます。 せん断波。\(M=\frac{1}{3}\mu\)、μ はせん断弾性率です。 P 波。\(M=K+\frac{4}{3}\mu\)、K は体積弾性率です。 レイリー表面波、ここで \(M=\frac{{(0.862+1.14\nu )}^{2}}{2{(1+\nu )}^{2}}\mu\) とポアソン波比率。 他の進行波と同様に、速度は v = λf として表すことができます。ここで、λ は空間波長、f は時間周波数です。 f と ρ が既知であるか、事前に固定されることがわかっている場合は、測定された λ から弾性率 M を直接計算できます。

参考文献のようにせん断波を仮定します。 29、31、および線形弾性等方性材料のヤング率は次のように求められます。

異種材料中を伝播する周期的な弾性波が与えられると、位置 x におけるその変位を次のように測定できます。

ここで、a は波の振幅、λ は空間波長、ϕ(t) は時間 t における波の位置を表す位相関数です。 次のような導関数に対する有限差分近似として局所ひずみを推定することもできます。

ここで、Δx はイメージング システムの解像度です。 十分にサンプリングされた正弦波のエネルギーがサンプルの次数に関係なく Nta2/2 であるとすると、λ は次のように求めることができます。

ここで、 \(\mathop{\sum }\nolimits_{t = 1}^{{N}_{t}}d{(t)}^{2}\) は、次のように表される一連の波の測定値からの変位エネルギーです。式で (4)。 式の推定値 (6) は参考文献で提示されたものと同等です。 29 で使用されています。 30. 式の推定値 (6) は、ノイズのないシステムでは、Δx → 0、時間サンプル数 Nt → ∞ として正確です。 この場合、ϕ(t) は ϕ(t) = kt の形式を取ることができます。ここで、k はスカラー、または均一な確率密度で [ − π, π] にわたるランダム関数です。 たとえば、 \(n \sim {{{{{{\mathcal{N}}}}}}}(0,{ \sigma }_{t}^{2})\)、式 (1) (6) は、十分な数の測定に対して依然として正確です。

式における波長推定は、 (6) はノイズのない場合に当てはまりますが、実際には位相ノイズによって大きくバイアスされます。 これは、シアー波長がミリメートル範囲 29,31 にあるためであり、これは OCT の空間サンプリング分解能よりもはるかに大きいため、付加的な広帯域ノイズは式 1 の勾配によって増幅されます。 (5)。

加法的ホワイト ガウス ノイズ (AWGN) の場合、分散あり \(n \sim {{{{{{\mathcal{N}}}}}}}(0,{\sigma }^{2})\) σ2、何らかのカーネル h でフィルタリングした後の信号エネルギーは次のとおりです。

ここで、Nh は h の長さです。 たとえば、式(1)の中心差分勾配近似は次のようになります。 (5) は、エネルギー En = 0.5σ2/Δx2 を持つカーネル h = [ − 0.5, 0, 0.5]/Δx を使用して変位ベクトルを空間的にフィルタリングすることと等価です。 σ がサンプルから推定できる場合は、偏りのない波長の推定値を次のように作成できます。

ここで、* は空間畳み込みを表します。

一方、等式。 (8) は適度に低いノイズでは合理的な場合がありますが、ノイズ エネルギーが信号エネルギーと類似している場合、大きな分散が生成されたり、未定義の推定値が生成されたりする可能性があります。 これは、Ng または Nt を増やすことである程度補償できますが、時間的応答速度とスキャン時間、または勾配方向の空間分解能が犠牲になり、分子が負になることは制御されません。 したがって、変位ベクトルに追加の 2D ローパス フィルターを導入します。 この偏りのないフィルタリングされた推定値は次のようになります。

ここで、g は 2D ローパス フィルター、Nh*g = Nh + Ng − 1 は有効ひずみフィルター カーネルの長さです。 サイズ Ng = ⌈2cg⌉ + 1 のリップル アーチファクトが発生しないため、g には 2D ガウス関数を使用します。ここで、cg はガウスの空間標準偏差です。 ガウス フィルターは、機械的コントラスト マップ上にスペックル パターンを生成しました。

式(1)のフィルタリングと効果的なノイズ電力削減にもかかわらず、 (9) では、潜在的な否定性により未定義の推定値が得られるケースが依然として存在する可能性があります。 これを回避するために、X 線コンピュータ断層撮影の散乱補正で使用されている「ソフトサブトラクション」アプローチを採用しています39。

これは演算 a − b を置き換えます。ここで、γ は次のように計算できる補正係数です。

ここで、β = [0, 1] は、この作業では β = 0.9 に設定した閾値項です。 私たちの実験では、これはサンプルの非常に深いところでのみ寄与し始めますが、いずれにしても強度が低すぎて信頼性の高い測定ができません。

この方法の最後の考慮事項は、ノイズ分散 σ2 を決定することです。 これは空間変化であり、波長が OCT システムの空間分解能よりも大幅に大きいという仮定の下では、スライディング 3 × 3 ウィンドウ内の時間平均分散として近似できます。

この研究では、合計で、1% のミルクを含む 1%、2%、および 3% のアガロース ハイドロゲルが製造されました。 簡単に説明すると、I 型アガロース (Fisher Scientific、英国) を蒸留水に加え、121 °C でオートクレーブにかけて 2%、4%、および 6% のアガロース溶液を作成しました。 脱脂粉乳（Bio-rad、英国）を蒸留水に溶解して 2% 乳溶液を調製し、この溶液を等量の 2%、4%、および 6% アガロース溶液と 100 °C で混合し、皿に流し込みました。室温で固化させて、1% ミルクを含む 1%、2%、および 3% アガロースゲルを生成します。 2/3% ハイブリッドゲルは、2% ゲルの一部を削り取り、3% アガロース溶液をディッシュに加え、固化させることによって作成しました。 次いで、生検パンチを使用してゲルをくり抜いて、直径６ｍｍ、厚さ２ｍｍのディスクを作製した。 次いで、これらのゲルを、各ゲルの表面を覆う100μLの蒸留水とともに96ウェル組織培養プレートに置き、前述したように波長測定のためにOCTで画像化した。

これらのアガロースゲルのヤング率は、Bose ElectroForce 5500 (TA Instruments、英国) を使用してテストされました。 簡単に説明すると、過剰な水をアガロースゲルから除去し、0.01 N のプレロードを使用してサンプルとプレート表面が直接接触するようにしました。 非拘束ランプ圧縮 (サンプル厚さの最大 10% のひずみ) を実行し、応力-ひずみ曲線からヤング率を計算しました。

ヒツジの後肢は地元の屠殺場から購入し、ヒツジ間葉系幹細胞 (MSC) を大腿骨の骨髄から単離しました。 したがって、この研究には倫理的な承認は必要ありませんでした。 2 継代の MSC をトリプシン処理し、200,000 個の細胞を V 底 96 ウェル プレート (Greiner bio-one) の各ウェルに加え、500 × g で 5 分間遠心分離して細胞ペレットを形成しました。

軟骨形成分化のために、細胞ペレットを、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリン、0.1 mg/mL ストレプトマイシン、100 μg/mL ピルビン酸ナトリウム、40 μg/mL L-グルコースを添加した高グルコース DMEM からなる分化培地で培養しました。プロリン、50 μg/mL L-アスコルビン酸-2-リン酸、4.7 μg/mL リノール酸、1.5 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA)、1 × インスリン-トランスフェリン-セレン、100nM デキサメタゾン (すべて Sigma-Aldrich 製)英国）および 10 ng/mL 組換えヒト TGF-β3（Peprotech、英国）を 3 週間培養し、培地は週に 3 回交換しました。 この分化期間中、分化を促進するためにペレットの半分に静水圧 (HP、270 kPa、1Hz、1 時間/日) を加えましたが、残りは刺激せず、対照として保持しました。 対照群と HP 群の両方を分化期間の終わりに採取し、波長測定のために OCT で画像化しました。 次に、サンプルをパパインで消化し、ジメチルメチレンブルー色素結合アッセイを使用してグリコサミノグリカン (GAG) 含有量を測定しました。 また、組織学のためにサンプルを採取し、ワックスを包埋し、切片にし、GAG 分布のために 0.1 M HCl 中の 1% アルシアン ブルー 8GX で染色しました。

骨形成分化のために、細胞ペレットを、10％ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリン、0.1 mg/ml ストレプトマイシン、100 nM デキサメタゾン、50 μM L を補充した低グルコース DMEM からなる分化培地中で培養しました。 －アスコルビン酸－２－リン酸および１０ｍＭ β－グリセルコ－リン酸（すべてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）を３週間、培地を週に３回交換した。 この分化期間中、サンプルは 3、10、21 日目に波長測定のために無菌状態で OCT を使用して継続的にモニタリングされ、並行培養中の別個のサンプルは同じ時点で機械的検査と組織学のために終了されました。 骨形成細胞ペレットのヤング率は、ミクロスフェアおよび細胞オルガノイドをテストするために設計されたカスタマイズされたリグを使用してテストされました40。 過剰な水分を除去した後、細胞ペレットを 2 つのプラテン表面の間に置き、一軸ランプ圧縮 (サンプル直径の最大 25% のひずみ) を実行し、応力-ひずみ曲線からヤング率を計算しました。 組織学的分析のために、細胞ペレットをワックスに包埋し、切断し、コラーゲン蓄積のためにピクロシリウスレッドで染色した。

コラーゲン/線維芽細胞マトリックスは、Timpson et al.41 に概説されている方法論を使用して作成されました。 マトリックスを 37 °C、5% CO2 で 15 日間インキュベートして、コラーゲン/線維芽細胞マトリックスを収縮させました。 コラーゲン/線維芽細胞マトリックスは、サンプル収縮の 1、4、7、11、15 日目に OCT を使用して画像化されました。

Hallas-Potts et al.42 に概説されているプロトコールを使用して、A2780 を上部に培養した 1 つのコラーゲン/線維芽細胞マトリックスと、上部に細胞を培養していない 1 つのブランクのコラーゲン/線維芽細胞マトリックスを調製し、金属グリッドに移しました。 コラーゲンマトリックスをグリッドに移動することを0日目とします。ディッシュを37℃、5% CO2で7日間インキュベートして、細胞を浸潤させました。 コラーゲン/線維芽細胞マトリックスは 2 日目と 7 日目に画像化されました。

OCT イメージングの直後、マトリックスをグリッドから取り外し、5 mL の 4% (w/v) パラホルムアルデヒド (PFA) を含むファルコン チューブに加え、一晩固定しました。 固定されたコラーゲン/線維芽細胞マトリックスはワックスに埋め込まれ、CRUK エディンバラセンター病理学およびフェノミクス研究所によって切片化され、ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色されました。 染色された切片は Nanozoomer XR モデルで画像化され、データは NDP スキャン v 3.1 を使用して取得されました。 倍率×40。

摘出したばかりのブタの目は地元の肉屋から購入しました。 角膜損傷を誘発するために、5 mm 生検パンチを使用して角膜中央に約 50% の深さまで部分的な切り込みを入れました。 次に、0.5% (w/v) フェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム (LAP) を含むメタクリル化シルクフィブロインの溶液 (15 または 20 wt%) を欠陥に充填し、5 分間光架橋しました (365 nm、 3mW/cm2）。 次に、新鮮な角膜、損傷した角膜、およびシルクフィブロインヒドロゲルで修復された角膜を、前述のように波長測定のためにOCTで画像化しました。 新たに調製した Silk-MA ハイドロゲルの貯蔵弾性率 (G) は、プレート-プレート形状 (Kinexus Pro+、Malvern、UK) を使用して 32 °C で振動モードで測定しました。 振幅掃引を実行して線形粘弾性範囲 (LVER) を決定した後、0.5% のせん断ひずみで周波数掃引を実行しました。 実験は３回繰り返して行われた。

振動エラストグラフィーの概念を実証するために、図 6 にまとめたように、一連の FEM シミュレーションを実行しました。これは、24 ウェルのポリスチレン プレートと不均一ゲルを含むメッシュ上で code_aster43 を使用して、1 つの角に軸方向に動的荷重を加えて実行されました。プレートの。 ゲルの中心面には厚さ 2 mm、直径 10 mm のノードが 36,000 個あり、その位置は合計 5 ms のシミュレーション時間にわたって 10 μs ごとにサンプリングされました。 刺激に使用された荷重信号は \(\sin (2\pi ft)/t\) で、f = 2 kHz、反対側のコーナーが境界条件として固定されました。荷重の他の組み合わせも同様の結果として生じる変位場でテストされました。そして見積もり。

a ウェル上のベースにゲルが固定されている様子を示します。 b t = 2 ms および t = 4 ms におけるプレートの変位の大きさを示します。 c プレートの角に加えられる加振力を示します。振幅が指数関数的に減衰する 2 kHz の正弦波です。 d ゲルの中心における軸方向の差動変位の例を示します。 e ゲル表面上の推定波長と 2 kHz のせん断波を仮定したグランド トゥルースを示します。 パネル f はプロファイル プロットであり、e に示されている線です。

このノイズのない場合に結果として生じる弾性波の波長は、式 1 を使用して推定されました。 (6)。 まず、実験セクションで使用した有効断面積に沿ってひずみを推定できるように、各時点での軸位置をゲルの中心を原点とする極グリッド上に再サンプリングしました。 式からの推定値 (6) は、t = [1, 4] ms の間の 400 の変位 (位置差) フィールドに適用されました。 最後に、これらの波長はデカルト グリッド上に再サンプリングされて画像が形成されます。

私たちは参考文献でも採用されている Blonski44 エッジメソッドのバリアントを使用します。 空間解像度の場合は 31: 最初にシグモイド関数をフィッティングします

パラメーター (L、k、x0、C) に対してレーベンバーグ・マルカート アルゴリズムを使用して、シグモイド導関数の半値全幅 (FWHM) を求めます。これは次のように表すことができます。

一元配置分散分析とそれに続く Matlab (The Mathworks) の Tukey-Kramer 検定を使用して、p 値 <0.01 または <0.05、サンプル数 N > 3 での有意差を検定しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

現在の研究中に生成された、および/または研究中に分析された光干渉断層撮影データセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 棒グラフの背後にある測定データセットは、figshare で見つけることができます。 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22148093.v3。

この論文で説明されているアルゴリズムを実装するための Matlab コードは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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ERC Advanced Award による AJEH への支援に感謝いたします。 638836: H2020_ERC_DYNACEUTICS および MRC UKRMP ハブがセル環境をエンジニアリングします。

これらの著者は同様に貢献しました: Jonathan H. Mason、Lu Luo。

エジンバラ大学 MRC 再生医療センター（英国、エディンバラ）

ジョナサン・H・メイソン、アメリア・ハラス＝ポッツ、ヴラスティミル・スルセン、ピエール・O・バニャニンシ

バーミンガム大学ヘルスケア技術研究所（バーミンガム、英国）

ル・ルオ & アリシア・J・エル・ハジ

ノッティンガム トレント大学工学部、ノッティンガム、英国

イヴォンヌ・ラインワルド

オックスフォード大学数学研究所、オックスフォード、英国

マテオ・タフタニ & サラ・ウォーターズ

がん研究英国エディンバラセンター、エディンバラ大学、エディンバラ、英国

アメリア・ハラス・ポッツ & C. サイモン・ヘリントン

MRC リプロダクティブ ヘルス センター、エディンバラ大学、エディンバラ、英国

リン・チージェン

バーミンガム大学化学工学部、バーミンガム、英国

イネス・A・バローゾ、Zhihua Zhang、Zhibing Zhang、アニタ・K・ガーグ

キール大学医学科学技術研究所、ストークオントレント、英国

インヤン

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JHM、LL、YR、YY、SW、AJEH、PB が研究、実験を計画し、論文を執筆しました。 JHM がアルゴリズムを作成しました。 JHM と LL は OCT スキャンを取得しました。 JHM、LL、YR、MF、AHP、VS、CJL、IAB、ZZ、AKG が実験を実施しました。 JHM、LL、CSH、AJEH、PB がデータを分析しました。

アリス・J・エル・ハジまたはピエール・O・バニャニンシへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Stefan Catheline と他の匿名の査読者に感謝します。 主な担当編集者: Alexander Cartagena-Rivera、Anam Akhtar、Christina Karlsson Rosenthal。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Mason, JH、Luo, L.、Reinwald, Y. 他周囲振動の偏りを軽減した光コヒーレンスエラストグラフィーにより、細胞、オルガノイド、組織の機械的特性をプロファイルします。 Commun Biol 6、543 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04788-0

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受信日: 2021 年 9 月 13 日

受理日: 2023 年 3 月 31 日

公開日: 2023 年 5 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04788-0

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